Vài năm trở lại đây, các bác sĩ thú y ít nhiều đã từng nghe qua “xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang” bên cạnh các xét nghiệm phổ biến hơn như công thức máu (sinh lý), sinh hóa, ELISA, PCR hay test nhanh. Vậy “xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang” là gì, hoạt động ra sao và ứng dụng thế nào? Hãy cùng Tiến Thắng tìm hiểu trong bài viết này nhé!

Lịch sử hình thành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (fluorescence immunoassay, hay FIA) xuất hiện lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 20 như một phương pháp tiên tiến để phân tích các chất sinh học. Sự ra đời của phương pháp này đánh dấu một bước tiến lớn trong lĩnh vực xét nghiệm y học, khi các nhà khoa học khám phá ra rằng huỳnh quang có thể được sử dụng để nhận biết và định lượng các phân tử sinh học.

Các thí nghiệm ban đầu tập trung vào việc gắn chất phát huỳnh quang vào kháng thể và quan sát phản ứng của chúng khi tiếp xúc với ánh sáng, cũng như thử nghiệm các chất phát huỳnh quang khác nhau để tìm ra loại phù hợp nhất cho xét nghiệm miễn dịch. Việc phát hiện ra chất huỳnh quang có độ nhạy cao và khả năng phát sáng mạnh mẽ đã mở ra nhiều cơ hội mới. Phương pháp này nhanh chóng được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực y học, từ chẩn đoán bệnh đến nghiên cứu sinh học, và đến ngày nay càng được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thú y, đặc biệt trên chó mèo, nơi nhu cầu chẩn đoán chính xác, nhanh chóng và hiệu quả là rất cao

Nguyên lý hoạt động của xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang hoạt động dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa kháng thể (antibody) và kháng nguyên (antigen). Đây là quá trình phức tạp nhưng hiệu quả, cho phép các nhà khoa học xác định chính xác nồng độ của các chất sinh học trong mẫu xét nghiệm. Khi kháng thể liên kết với kháng nguyên, một chất huỳnh quang được gắn vào kháng thể (hoặc kháng nguyên) sẽ phát sáng khi được kích thích bằng ánh sáng ở bước sóng cụ thể. Cường độ phát sáng, thường tỷ lệ (thuận hoặc nghịch) với nồng độ chất cần xét nghiệm, được đo bằng máy quang phổ để định lượng nồng độ kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu.

Miễn dịch huỳnh quang có hai dạng kỹ thuật chính:

• Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: Kháng thể (kháng nguyên) được đánh dấu bằng chất huỳnh quang sẽ gắn trực tiếp với kháng nguyên (kháng thể) trong mẫu.
• Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: Kháng thể sơ cấp không được đánh dấu, nhưng sau đó được phát hiện bằng một kháng thể thứ cấp có gắn chất huỳnh quang.

Hoạt động của que test trong xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang:

Que test miễn dịch huỳnh quang có thể hoạt động theo kiểu sandwich (cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ mẫu) hoặc kiểu cạnh tranh (cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ nghịch với nồng độ mẫu)

Cấu tạo của que test gồm:

1. 1. Đệm chứa mẫu: Nơi nhỏ mẫu trên que test.
   2. Đệm tiếp hợp: Chứa kháng thể hoặc kháng nguyên đã gắn hạt nano huỳnh quang.
   3. Màng nitrat xenlulo: Nơi mẫu chảy qua dọc theo que test, chứa vạch T (gắn kháng thể [kháng nguyên] đặc hiệu với kháng nguyên [kháng thể] có trong mẫu), và vạch C (bắt giữ thành phần có gắn huỳnh quang để kiểm tra chất lượng). Trong kiểu cạnh tranh, vạch T gắn kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể được gắn nano huỳnh quang ở đệm tiếp hợp.
   4. Đệm thấm hút: Chứa lượng mẫu còn lại sau khi phản ứng.

Bước 1

Sau khi nhỏ mẫu vào que test, kháng nguyên (kháng thể) trong mẫu gắn với kháng thể B (kháng nguyên B) được gắn sẵn hạt nano huỳnh quang tại đệm tiếp hợp, hình thành phức hợp kháng nguyên mẫu–kháng thể B huỳnh quang (kháng thể mẫu–kháng nguyên B huỳnh quang).

Bước 2

Dưới tác động của mao dẫn, phức hợp sẽ chảy dọc theo màng nitrat.

Bước 3

Phức hợp bị giữ lại khi đi qua vạch T được gắn sẵn kháng thể A (kháng nguyên A) đặc hiệu với kháng nguyên (kháng thể) của mẫu, tạo thành phức hợp kháng thể A–kháng nguyên mẫu–kháng thể B huỳnh quang (kháng nguyên A–kháng thể mẫu–kháng nguyên B huỳnh quang). Trong kiểu cạnh tranh, phức hợp trôi qua vạch T, còn lại kháng thể B huỳnh quang không gắn với kháng nguyên của mẫu sẽ bị kháng nguyên A ở vạch T giữ lại, hình thành phức hợp kháng nguyên A–kháng thể B huỳnh quang.

Bước 4

Theo dòng chảy, kháng thể huỳnh quang tự do (không gắn kháng nguyên) hoặc phức hợp kháng nguyên-kháng thể huỳnh quang bị giữ lại ở vạch C cho thấy dòng chảy và phản ứng xảy ra đúng kỹ thuật.

Bước 5

Sau khi được nguồn sáng kích thích chiếu vào, vạch T và C sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và được đầu dò quang học ghi nhận cường độ tín hiệu. Cường độ tín hiệu sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ xét nghiệm trong kiểu sandwich và ngược lại trong kiểu cạnh tranh.

Các nhóm chỉ số xét nghiệm bằng miễn dịch huỳnh quang và ứng dụng

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang trên thú y hiện nay được dùng để kiểm tra đa dạng các chỉ số, bao gồm: kháng nguyên, kháng thể và các chỉ dấu (marker) sinh học.

Đối với kháng nguyên, xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang có thể dùng để phát hiện các tác nhân truyền nhiễm trên chó và mèo như virus (distemper virus, parvovirus, calicivirus, herpesvirus, coronavirus v.v.), vi khuẩn (Leptospira, Helicobacter pylori v.v.) hay kí sinh trùng (giun tim, Giardia v.v.), do có thể ứng dụng rất tốt trong việc chẩn đoán bệnh.

• Cần lưu ý rằng việc xét nghiệm kháng nguyên ngay sau khi vừa chủng ngừa bằng vaccine sống nhược độc có thể dẫn đến kết quả dương tính, do virus giảm độc lực trong vaccine vẫn còn khả năng nhân đôi và gây nhiễm bệnh nhẹ để kích thích đáp ứng miễn dịch.

Đối với kháng thể, xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang có thể dùng để phát hiện kháng thể được cơ thể sinh ra do phản ứng miễn dịch với kháng nguyên là tác nhân truyền nhiễm. Đối với kí sinh trùng đường máu như Ehrlichia, Anaplasma, Borrelia (bệnh Lyme), Leishmania hay Babesia rất khó để xét nghiệm bằng kháng nguyên, việc kiểm tra nồng độ kháng thể phản ánh phản ứng của cơ thể khi có sự hiện diện của kí sinh trùng, từ đó có thể kết hợp với lâm sàng để chẩn đoán. Ngoài ra, xét nghiệm kháng thể còn được ứng dụng trong chủng ngừa bằng việc đánh giá khả năng sinh miễn dịch và thời gian bảo hộ sau tiêm vaccine, giúp cá thể hóa kế hoạch tiêm phòng cho từng vật nuôi, tránh việc chủng ngừa không hiệu quả (do bảo quản thuốc sai cách, bị kháng thể mẹ truyền trung hòa) hoặc không cần thiết gây lãng phí (vẫn còn kháng thể bảo hộ từ lần tiêm trước).

• Cần lưu ý rằng việc xét nghiệm kháng thể dương tính có thể do đã từng nhiễm bệnh từ trước (đã điều trị), cần kết hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác để kết luận việc nhiễm bệnh ở thời điểm hiện tại.

Đối với chỉ dấu sinh học, xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang có thể dùng để phát hiện đa dạng các chỉ dấu (mang tính kháng nguyên) phản ánh quá trình viêm (CRP, SAA), chức năng tụy (cPL, fPL), chức năng thận (SDMA, CysC), chức năng tuyến giáp (TT4), chức năng gan mật (CG), tổn thương cơ tim (NT-ProBNP, cTnI), huyết khối (D-Dimer) v.v. hỗ trợ rất tốt trong việc kiểm tra sức khỏe, chẩn đoán sớm, đánh giá khả năng hồi phục và tiên lượng bệnh.

So sánh miễn dịch huỳnh quang với một số công nghệ chẩn đoán khác trong thú y

Khi so với test nhanh, cả hai đểu là xét nghiệm miễn dịch, tuy nhiên test nhanh ứng dụng nguyên tắc phát hiện màu bằng tinh chất vàng keo (colloidal gold) nên thường chỉ định tính hoặc bán định lượng, dễ đọc bằng mắt thường. FIA, nhờ tín hiệu huỳnh quang được đọc bằng thiết bị chuyên dụng, nên đem đến độ nhạy cao hơn và khả năng định lượng chính xác hơn, đặc biệt đối với mẫu có nồng độ thấp. Thời gian chờ và đọc kết quả của cả hai phương pháp tương đương nhau, tuy nhiên FIA cần thêm máy đo huỳnh quang, bù lại quá trình chờ và đọc được tự động hóa giúp giảm sai số thủ công.

Khi so với PCR, FIA khác biệt về nguyên lý khi PCR phát hiện vật liệu di truyền (DNA hay RNA) thay vì miễn dịch. PCR có thể cho độ nhạy và độ đặc hiệu tốt hơn FIA khi chọn được đoạn mồi phù hợp. Bù cho những lợi ích so với FIA, PCR yêu cầu dụng cụ, thiết bị phức tạp, kỹ năng cao và thời gian xét nghiệm lâu hơn, đồng thời cũng tốn kém hơn về chi phí.

Kết

Thông qua bài viết này, Tiến Thắng hy vọng các bác sĩ thú y có thể hiểu rõ hơn về phương pháp xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang, nguyên lý hoạt động và phạm vi ứng dụng. Mong rằng kỹ thuật này có thể hỗ trợ các bác sĩ thật nhiều trong công tác thăm khám, chẩn đoán và điều trị bệnh!